1.引言

【资料图】

乳状液的定义是“由两种不相容的液体组成的体系，其中一种以液滴(分散或内相)的形式分散在另一种(连续相或外相)中”。水包油乳状液包含分散在水状连续相中的小油滴，每个油滴周围都有乳化剂分子的保护层。临床上，脂肪乳剂大多通过静脉注射给药，通常用于需要肠外营养作为必需脂肪酸来源的患者。近年来，脂肪乳剂已被用作难溶药物的给药载体。脂肪注射乳剂的质量控制指标包括外观、颗粒大小和分布、pH值、Zeta电位和脂质氧化。颗粒大小对乳液的外观、流变性、颜色、质地、稳定性和保质期等许多特性起着关键作用；各种因素，如配方设计，包括油相、水相和乳化剂的选择，甚至乳液的容器，都可能对颗粒大小和粒度分布产生影响。要生产出粒度细小、粒度分布窄的乳液，要么需要大量的能量，要么需要大量的表面活性剂，或者两者的结合。乳状液的生产方法有两种：低能乳化和高能乳化。低能乳化方法，如相转化温度技术，涉及通过改变影响体系亲水亲油平衡(HLB)的因素而引起的过渡性转化。这种方法有几个局限性，包括在制备过程中需要大量的表面活性剂，并且不能用于大规模的工业生产。高能乳化利用高压均质机、微流化器和超声方法等机械设备，可以产生强烈的破坏力，打破油相和水相，并导致微小油滴的形成。高能乳化方法适用于工业操作，因为可以灵活地控制乳滴的尺寸分布，并且所需的能量通常可以在高压系统中实现。在实验室研究和大多数乳状液制备中，通过两个步骤生产乳状液更高效、更方便：(1)通常通过转子-定子装置将分离的油和水相转化为粗乳状液；(2)然后使用高压系统制备最终的细乳状液。

平均液滴尺寸和尺寸分布是脂肪注射乳剂制备过程中的两个重要参数。此外，注射乳剂中直径大于5μm的脂肪滴也应考虑在内，因为它们与乳剂的稳定性和安全性有关。当超过5μm的脂肪滴体积重量百分比(PFAT5)超过0.4%时，可以直观地观察到相分离；然而，较大的PFAT5也会导致安全问题，如肺部血栓和肝功能异常。美国药典(USP)强调，“这两个球粒大小分布区域(MDS和PFAT5)必须控制在规定的范围内”。USP在第729章中提出了具体的球体大小分布限制。它推荐了两种测定颗粒大小的方法：方法I和方法II。方法I涉及光散射技术，用于测定脂类注射乳剂中的平均液滴尺寸，MDS不应超过500nm。方法II是一种光遮盖法(LO)或消光法(LE)，用于测定脂类注射乳剂中大直径液滴尾部(>5μm)的程度，PFAT5不应超过总脂成分的0.05%。

随着均质压力和再循环的增加，MDS趋于减小，但有趣的是，较高的压力和较长的乳化时间可能会导致过度加工，从而可能导致MDS增加。然而，过度处理对PFAT5的影响还没有被评估，因为研究人员之前关注的是平均颗粒尺寸的行为，而不是大液滴尺寸的行为。本研究的目的是系统地考察转子-定子系统、均质压力、均质次数、间隔放置时间和不同储存条件对MDS和PFAT5的影响，并确定在乳化液制备过程中影响MDS和PFAT5的关键因素。

2.材料和方法

2.1材料

大豆油(长链甘油三酯)和中链甘油三酯(中链甘油三酯)由中航药业提供(中链甘油三酯：批号：13060105-2-01；中链甘油三酯：120901-2-01，铁岭，中国)。胆固醇购自南京新百药房(南京，中国，批号121201)。甘油购自嘉禾生物科技公司(汕头中国地段131207号)。泊洛沙姆188购自巴斯夫公司(批号：WPCH530B，德国)。大豆卵磷脂购自东森生物科技公司(批号560400-2130332-01，LipoidGmbH，德国)。盐酸由北京化工厂(北京20140316号，中国)供应。所有溶液均用双蒸水制备。

2.2乳状液的制备

我们实验室开发了一种新型的不含乳油、高压灭菌器稳定的紫杉醇静脉乳剂，以紫杉醇-胆固醇复合体作为药物载体来改善紫杉醇在乳剂油相中的溶解度。根据现有的紫杉醇乳剂的成分和生产工艺，将空白的紫杉醇乳剂(不含药物)作为试验对象。首先，胆固醇在60℃下溶解在20%MCT/LCT(平均链甘油三酯/豆油质量比为1：1)中。然后，将大豆卵磷脂、泊洛沙姆188和甘油组成的水相在60℃的水浴中均匀分散。然后，使用福尔科均质机FA25型(福尔科设备上海有限公司，中国)在60℃下高剪切混合制备粗乳液，在10,000转/分的条件下将油相快速加入水相中。高剪切混合过程在19,000rpm下进行8min，通过使用均质设备(德国APV-2000)在1000bar下进行7个循环的高压均质获得最终乳状液。在循环冰水浴中，整个均质过程的温度保持在40℃以下。用0.1M的盐酸将乳状液的pH值调节到4.5，最后将乳状液转移到小瓶中，并使用高压灭菌器(ZDX-35SBI，上海沈安医疗器械)在115℃下高压灭菌30min。

2.3研究设计

采用相同的配方和不同的工艺参数制备了不同批次的乳剂。在不同温度(25℃、40℃和60℃)下制备了粗乳液。使用UltraTurrax模型将油均质到水相。在此过程中，使用不同的旋转速度(从13,000转/分到19,000转/分)或旋转时间(从4min到8min)来制备不同的粗乳液。将一批粗乳状液(水浴温度：60℃，转速：19,000rpm，旋转时间：8min)放置不同时间(30-120min)，模拟乳状液制备过程中的意外中断，然后通过高压均质机。部分粗乳液在400-1300bar的不同压力下使用7个循环进行均质，而其他部分在1000bar下使用不同的均质再循环，从1次到9次。均质室使用含有大约5℃冷水的冷却夹套进行冷却，以减缓温度上升。用0.1MHCl将各乳剂的pH值调节至4.5。氮气吹扫后，将乳状液等分成几个圆柱形玻璃管(体积为10mL；内径为20mm；高度为40mm)，在115℃下高压灭菌30min。每种乳剂都经过仔细收集，并在4℃下保存，然后进行粒度分析。考察了乳化液制备过程中可能影响粒径大小的各种因素。乳液的制备如表1所述。

表120%MCT/LCT注射乳剂的能量输入参数

大多数乳状液在4℃存放1晚后进行了粒度(MDS和PFAT5)分析。使用上述标准工艺参数制备的一批乳剂(批号20140522-K)被分成几个瓶。有些瓶子暴露在环境中或高温(60摄氏度)中至少10天，每5天测量一次颗粒大小。其他乳剂等分在4℃、15℃或25℃下储存至少2个月，并测量每个月的粒度。

2.4分析方法

用动态光散射(DLS)法测定了乳液的MDS和多分散指数(PI)。等电点是反映乳化液粒径分布状况的重要参数，等电点值越小，乳胶粒的分布越集中。通常需要MDS和PI来反映平均乳化液颗粒大小。使用的衍射仪型号为NiComp380ZLS亚微米粒度仪，Zeta电势分析器子系统(美国加利福尼亚州圣巴巴拉市粒子大小系统)配备了635nm红色激光二极管和高增益光电倍增管检测器，可检测尺寸从0.5nm到6μm的粒子。在衍射仪中用蒸馏水将乳状液稀释至约1/500，搅拌，稀释乳状液测量至少5min。对每个样本重复测量两次。由于布朗运动导致悬浮颗粒的随机运动，稀释后的样品颗粒分散在溶剂中。单色相干激光照射悬浮液，散射光强起伏的时间尺度与颗粒的大小有关。较小的粒子在溶液中会相对较快地出现抖动，产生快速波动的强度信号；相比之下，较大的粒子扩散会较慢，导致强度变化较慢。光电倍增管探测器以一定的角度(如90°)采集波动的强度信号，并将波动的强度信号传输到数字相关处理器。然后就可以得到扩散系数D。根据D，我们可以使用著名的斯托克斯-爱因斯坦关系来计算粒子半径R：

D=kT/6πηR(1)

其中k是玻尔兹曼常数(1.38×10⁻¹⁶ergK⁻¹)，T是温度(K=℃+273)，η2是溶剂的剪切粘度(例如，ηHeSe×10⁻²在20℃的水中的平衡)。

使用遮光/单粒子光学传感(LO/SPOS)方法进行大直径尾部评估。AccuSizer780APS自动颗粒测定仪(美国加利福尼亚州圣巴巴拉的颗粒大小系统)配备了自动稀释系统，并以消光模式连接到LE400-05传感器，该传感器之前使用聚苯乙烯乳胶球进行了校准，用于检测大直径尾巴。使用自动瓶采样器从每个容器中取出乳剂样品，并将其转移到稀释系统。根据每种产品的油浓度设定适用的稀释系数，以达到可接受的累积颗粒计数水平，这大约是传感器符合限度(9000颗粒/mL)的三分之一。样本至少一式三份，平均值是报告的。使用颗粒计数器评估脂肪乳剂中存在的大油滴数量的计算和技术已在其他地方描述。数据的标准化需要使用以下公式将每个大小通道的结果转换为其等效球形体积(ESV)：

ESV=(π×D³)/6(2)

其中D是每种尺寸通道的直径(以厘米为单位)，ESV以立方厘米(cm³)表示。然后将粒子数量乘以ESV，得到给定数据通道的计算总球形体积(TSV)：

TSV=numberofparticles×ESV(3)

然后使用以下公式计算以增大的脂球形式存在的可注射乳剂中脂肪浓度的百分比：

其中LCT/MCT的浓度为0.93g/mL。根据>5μm的颗粒大小分布数据计算PFAT5值。

3.结果与讨论

乳化液能量输入参数包括与粗乳制备有关的水浴温度、转速和时间，以及与均化过程有关的均质压力和回流。这些参数的选择基于先前的一项研究：转速、曝光时间、间隙距离和圆盘设计，其中能量输入参数属于转子-定子系统，均质压力、再循环和喷嘴设计属于高压系统。由于剪切头和均质机是固定的，间隙距离是固定的，圆盘设计和喷嘴设计是恒定的，所以剩下的参数代表了整个乳液制备的关键步骤。针对乳状液制备过程中粗乳状液不能均化或乳状液不能及时氮气密封的问题，考虑了不同的粗乳和均化时间对乳状液粒径的影响。由于设备故障、停电和其他紧急情况，这是不可避免的。制备的乳液呈现为白色外观的乳状液体，在当前的研究中检测了MDS、PI和PFAT5。改变三个参数(水浴温度、转速和旋转时间)中的任何一个都可以得到0.035%-0.042%的PFAT5值，170nm-180nm的MDS和0.1-0.2的PI波动。改变与粗乳化液相关的能量输入参数似乎对MDS和PFAT5值几乎没有影响。改变粗乳液的制备工艺不会影响MDS和PFAT5值，因为在一定压力下，粗乳液经过高压均质后，其粒径有较大幅度的减小。

表2改变与制备粗乳液过程相关的技术参数的粒度结果

为了研究在环境温度下暴露一段时间对粗乳状液颗粒尺寸(MDS和PFAT5)的影响，将一批粗乳状液在常温下暴露在空气中(盖上盖子以防止乳状液受到污染)30min、60min或120min，然后按时间顺序均质。结果如表2所示。PFAT5值接近0.038%，在0.04%的波动范围内。MDS值约为170nm，等电点约为0.1。考虑了多种因素(如测定误差)，粗乳液在均质前于常温下孵育120min，对MDS和PFAT5值几乎没有影响。粗乳状液孵育不同时间，然后在1000bar压力下循环7次。平均液滴直径从旋转结束时的2373nm降至均质后的168.7nm，孵育30min后的2373nm降至均质后的174.3nm，孵育60min后的1600nm降至均质后的177.9nm，孵育120min后的1526nm降至均质后的166.5nm。均质前的PFAT5值高达117%。30min、60min、120min分别为117%、109%、96%，匀浆后分别降至0.038%、0.037%、0.034%、0.042%。这些结果表明，均化在乳状液中形成小液滴时特别有效，而转子-定子系统中的液滴破坏通常不如高压设备有效。由于转子-定子系统的分散区通常具有较大的体积，在恒定的能量密度和体积流量下，转子-定子系统的平均功率密度低于高压装置喷嘴中的平均功率密度。无论乳液多粗，在相同的均化压力下，经过相同的均化再循环，可以得到相同的细小水平的PFAT5和MDS。然而，转子-定子系统仍然很重要，因为它可以有效地将分离的油和水相转化为具有相当大液滴尺寸的大乳液，以减轻均质器的磨损。UltraTurrax模型在乳液制备中被广泛使用，因为它操作简单，并且可以在低剪切力下产生良好的分散效果(表2，图1)。

图1乳状液在1000bar下均质前后的颗粒大小比较

图1.(A)均化前后测量的乳状液的平均液滴尺寸(MDS)值;(B)在均化前后测量的乳剂中超过5μm(PFAT5)值的脂肪液滴的体积重量百分比。